分子克隆有詳細的描述,具體步驟如下:
1、估算含有質粒溶液的體積V,加入V/9體積的3M NaAc,(我喜歡在質粒溶液中再加入一定量的水,使得總體積大概在270ul 左右,之后加30ul NaAc)使NaAc終濃度為0.3M。
2、加入2倍體積冰冷無水乙醇,冰上孵育或-20度 20min,
3、**大速度離心10min,
4、用75%乙醇洗滌2次(每次700ul即可),
5、室溫晾干,
6、加入適當體積的水或TE buffer溶解即可。
質粒濃縮的辦法總的來說是利用乙醇沉淀DNA的原理進行.shou先你應當確定你提取的質粒量有多大,體積多少,這樣才好確定濃縮的優化策略,詳細步驟介紹如下:
1 確定體積,一般需要加2.5倍原始DNA溶液體積的95%乙醇(如果你提的質粒純度好的話,可以將乙醇在-20度冰箱預冷后加入效果更好),同時加入1/10倍原始DNA溶液體積的醋酸鈉(3M,pH4.8),;
2 離心,以離心機**大速度(13000rpm以上)離心10分鐘;
3 倒掉上清,用10ul槍頭吸去離心管里剩余的水,但不要吸到DNA;
4 室溫放置10~15分鐘,直**DNA剛剛晾干,但又不能干透成白色不透明狀;
5 用適量去離子水或TE溶解**你所需要的濃度。
為了濃縮達到你所需要的濃度,你應先對質粒定量,如果質粒總量小于2ug,在沉淀時可以加入1ul的糖原,以便于操作。
biomiga-EndoFree plasmid ezFlow maxi kit(快速法)-內有質粒濃縮方法 注:得到的DNA需要濃縮,請加入0.1倍體積的3M的醋酸鈉(pH5.2)和0.7倍體積的異丙醇,室溫10min,室溫下高速離心10分鐘,底部可見白色的DNA沉淀,棄去上清,加入1 mL70%乙醇,高速離心5分鐘,棄去上清,空氣干燥20分鐘,加入Endofree Elution Buffer重新溶解質粒DNA。 沉淀DNA時,醋酸鈉和異丙醇一定要用常溫的否則鹽可能也被沉淀下來。
如果提取的不是特別微量的樣品, 乙醇或異丙醇沉淀的時間**好不要太長, 因為過長時間的沉淀會造成沉淀中的鹽分升高, 影響PCR和酶切.
因此我個人都是:genomic DNA: 2V乙醇+0.1V 3M NaAc,室溫10min; plasmid(堿裂解法):2V乙醇/1V異丙醇,室溫10min; RNA: 1V異丙醇,室溫5min(很多G外RNA相關實驗的Kit專門說明了不要超過5min,否則有可能影響后續實驗). 低溫有助于低豐度/小片段沉淀, 因此可以據具體情況-20度沉淀,但沉淀的時間**好不要太長, 事實上長時間不會對沉淀量有質的改變,因此結合保證質量和提高效率兩大原則,不要選擇長時間沉淀. 當室溫靜置片刻后離心,看不見沉淀,大可以再移入 -20C 處理的。