蛋白質濃縮問題——超濾濃縮管的使用及保存
二、離心超濾管濃縮樣品
2.1 濃縮樣品
1、要濃縮的樣品含鹽量必須0.3M以上，含鹽量低的樣品須補加到0.3MNaCl。
2、在內管（附有3KD膜）中加入500µl樣品，將內管套入外管。
3、對稱放置離心管，14520rpm(即14000g)離心。（離心5min約濃縮2倍，10min約4倍，15min約6倍，20min約8倍，30min約10倍）。
4、離心結束后，將內管倒置套在另一個干凈的離心管呢，3880rpm離心min收集濃縮后的樣品。或者用移液器直接吸出內管中的樣品。
2.2 濃縮管使用后的處理和保存
1、使用完的濃縮管，立即加入500µl含1MNaCl的緩沖液（此緩沖液與濃縮樣品的緩沖液一致），8000rpm離心20min。
2、甩凈內管中的鹽溶液，將內管放入超純水中浸泡1h。
3、內管加入超純水500µl，8000rpm離心5min。
4、甩凈內管中的水，加入500µl0.2MNaOH，8000rpm離心20min。
5、甩凈內管中的NaOH溶液，用超純水再8000rpm離心5min。
6、甩凈內管中的水，放入含0.2-0.5‰NaN3的生理鹽水中。
7、外管用自來水洗凈后，用超純水沖洗干凈，晾干。
超濾管使用注意事項
蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管（MWCO10kD）。也有其它型號 的、不同體積大小和MWCO超濾管可選，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標體積而定。可重復使用，使用一次就扔掉太浪費。以下是個人總結的使用方 法和注意事項。
1、選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃縮體積，**常見的是Ultra-15（10kD）。到底選擇多大截留分子量比較合適呢？10kDa、 5kDa、還是30kDa？通常應截留分子量不應大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右，則可以用截留分子量3kD的超濾管。認真閱讀使用說明書，注意超濾膜對各種化學物質的耐受程度有所不同，表格中有。
2、新買來的超濾是干燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全過膜，冰浴或冰箱里預冷幾分鐘。然后將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過管頂的白線為準。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預冷。
3、平衡。質量和重心二者都要達到平衡。注意轉速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾（離心機預冷**4度）。不同離心機的轉速 rpm換算成g之后，有所不同。具體可參閱附件里的說明書。離心機的加速度調****低檔，減小對膜的壓力。注意，一定要等離心機達到目的轉速之后，方可離開 離心機，否則離心機出問題時，無法**時間處理，后果不可預測！膜與轉軸的方向根據說明書調整（角轉離心機的情況是膜與軸垂直）。在實際使用中，一般轉速 開的比說明書里的要低，這樣可以延長離心管的使用壽命。
4、當濃縮到剩下1ml時，取50ulG產Bradford溶液，加入10ul流穿，看有沒變藍色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要精確判斷是否漏管，用5mgml的BSA離心10min，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測，繼續加入剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作，防止蛋白受熱），直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發生蛋白沉淀，導致堵管。若發生沉淀，要確定沉淀的具體原因，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適；前者可用多根超濾管同時超濾，降低濃度的辦法解決，后者的方法是換不同的Buffer，直到蛋白不發生沉淀為 止。
5、前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮**1ml左右的時候，輕輕加入新的Buffer（經0.22um超濾膜超濾），再 濃縮**1ml左右，連續三次，**后一次的濃縮終體積根據需要的蛋白濃度而定，一般不多于500ul，也有濃縮**200ul以內的情況。按照每次**少10倍 左右的體積濃縮算，三次達到1000倍以上，基本上可以達到換buffer的目的。
