SDS－PAGE電泳的基本原理及濃縮膠濃縮樣品的原理

SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）是目前**常用的分離蛋白質的電泳技術
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統中引進SDS， SDS能斷裂分子內和分子間氫鍵，破壞蛋白質的二級和三級結構，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結合，形成帶負電荷的SDS-蛋白質復合物，這種復合物由于結合大量的SDS，使蛋白質喪失了原有的電荷狀態形成僅保持原有分子大小為特征的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質的結合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質分子的遷移速度取決于分子大小。當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數，若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量對數作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。

SDS-PAGE電泳成功的關鍵是什么？

①溶液中SDS單體的濃度  SDS在水溶液中是以單體和SDS-多肽膠束的混合形式存在，能與蛋白質分子結合的是單體。為了保證蛋白質與SDS的充分結合，它們的重量比應該為1∶4或1∶3。 ②樣品緩沖液的離子強度  因為SDS結合到蛋白質上的量僅僅取決于平衡時SDS單體的濃度，不是總濃度，而只有在低離子強度的溶液中，SDS單體才具有較高的平衡濃度。所以，SDS電泳的樣品緩沖液離子強度較低，常為10-100 mM。 ③二硫鍵是否完全被還原  只有二硫鍵被完全還原以后，蛋白質分子才能被解聚，SDS才能定量地結合到亞基上從而給出相對遷移率和分子質量對數的線性關系。Sample buffer中的β-巰基乙醇的濃度常為4-5%，二硫蘇糖醇的濃度常為2-3%。前者有揮發性，**好使用前加入。

SDS-PAGE緩沖液系統的選擇，Tris-Glycine、Tris-Tricine、Tris-硼酸鹽或者其他？

一般來說，在被分析的蛋白質穩定的pH范圍，凡是不與SDS發生相互作用的緩沖液都可以使用，但緩沖液的選擇對蛋白帶的分離和電泳的速度是非常關鍵的。Tris-甘氨酸系統是目前使用**多的緩沖系統。Tris-甘氨酸系統是目前使用**多的緩沖系統。如果要測定糖蛋白的分子量，**好采用Tris-硼酸鹽緩沖系統，對于分子質量小于15 kDa的蛋白樣品，可以使用SDS-尿素系統，也可以采用Tris-tricine緩沖系統。

積層膠（或稱濃縮膠）的作用原理？

在緩沖系統中的弱酸，如甘氨酸，在pH6.7時很少解離，其有效泳動速率很低，而氯離子卻有很高的泳動速率，蛋白質的泳動速率介于兩者之間。加上電壓以后，作為先導離子的氯離子和尾隨離子的甘氨酸離子分離開來，并在其后面留下一個導電性較低的區帶。由于導電性和電場強度成反比，這一區帶便獲得較高的電壓梯度，加速甘氨酸離子的泳動，使其趕上氯離子，建立起甘氨酸和氯離子的電壓梯度和泳動速率乘積相等的穩定態（我不太明白這句話），使這些帶電顆粒以相同的速度泳動，兩種離子之間有明顯的邊界。當甘氨酸、氯離子界面通過樣品進入濃縮膠時，在移動界面前有一低電壓梯度，界面后有一高電壓梯度。由于在移動界面前的蛋白質分子泳動速率比氯離子低，因此氯離子能迅速越過。移動界面后的蛋白質處于較高的電壓梯度中，其泳動速率比甘氨酸快。因此，移動的界面將蛋白質分子堆積到一起，形成一條狹窄的區帶。蛋白質在移動界面中的濃度作用僅取決于樣品和濃縮膠中Tris-HCl的濃度（為什么？），而與樣品中蛋白質的**初濃度無關。由于濃縮膠為大孔凝膠，故對蛋白樣品沒有分子篩作用。當移動的界面到達濃縮膠和分離膠的界面時，凝膠的pH明顯增加，導致甘氨酸大量解離。此時，甘氨酸的有效泳動速率明顯增加，超越蛋白分子，直接在氯離子后移動。由于凝膠孔徑變小，蛋白質分子的遷移速率降低，落在后面的蛋白質便在均一的電壓梯度和pH環境中泳動，并根據其固有的電荷與分子大小進行分離。

SDS-page電泳小問答
Q：SDS－PAGE電泳的基本原理？
A：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統中引進SDS（十二烷基硫酸鈉）， SDS能斷裂分子內和分子間氫鍵，破壞蛋白質的二級和三級結構，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結合，形成帶負電荷的SDS-蛋白質復合物，這種復合物由于結合大量的SDS，使蛋白質喪失了原有的電荷狀態形成僅保持原有分子大小為特征的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質的結合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質分子的遷移速度取決于分子大小。當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數，若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量對數作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。
　　
Q：配膠緩沖液系統對電泳的影響？
A：在SDS－PAGE不連續電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris－HCL緩沖系統，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris－甘氨酸緩沖系統。在濃縮膠中，其pH環境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導電性較低的區帶，蛋白分子就介于二者之間泳動。由于導電性與電場強度成反比，這一區帶便形成了較高的電壓剃度，壓著蛋白質分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區帶。當樣品進入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據其固有的帶電性和分子大小進行分離。#p#分頁標題#e#
　　所以，pH對整個反應體系的影響是**關重要的，實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應shou要考慮該因素。
　　
Q：樣品如何處理？
A：根據樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。
1、還原SDS處理：在還原劑中加入SDS和DTT（或Beta巰基乙醇）后，蛋白質構象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結合的分子，在電泳中，只根據分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。
2、帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經久牢固的保護SH基團，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現象。100ul樣品緩沖液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。
3、非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用。
　　
Q：SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用？
A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質電泳提供載體，其凝固的好壞直接關系到電泳成功與否，與促凝劑及環境密切相關；
制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇tris－HCL系統，具體作用后面介紹；
TEMED與AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；
十二烷基硫酸鈉（SDS）：陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質電荷、解離蛋白質之間的氫鍵、取消蛋白分子內的疏水作用、去多肽折疊。
　　
Q：提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑？
A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導致凝固不充分，后者可導致SDS結晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。
　　2、一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的《蛋白質電泳技術手冊》P82-103。
　　
Q：“微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？
A：主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現于較厚的凝膠中。
　處理辦法：待其充分凝固再作后續實驗。
　　
Q：“皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？
A：主要出現在蛋白質垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。
　　處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。
　　
Q：為什么帶出現拖尾現象？
A：主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。
　　處理辦法：加樣前離心；選擇適當的樣品緩沖液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度。
　　
Q：為什么帶出現紋理現象？
A：主要是樣品不溶性顆粒引起的。
　　處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。
　　
Q：什么是“鬼帶”，如何處理？
A：“鬼帶”就是在跑大分子構象復雜的蛋白質分子時，常會出現在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質分子重新折疊結合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻于目標條帶有相同的免疫學活性，在WB反應中可見其能與目標條帶對應的抗體作用。
　　處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。
　　
Q：為什么溴酚藍不能起到指示作用？
A：我們在實驗中常會遇到溴酚藍已跑出板底，但蛋白質卻還未跑下來的現象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關。
　　處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。
　　
Q：為什么電泳的條帶很粗？
A：電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。
　　處理辦法：適當增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確（6.7）；適當降低電壓；
　　
Q：為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？
A：這種現象一般初學者易出現。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的jue緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。
　　處理辦法：電泳槽正確裝配即可。
　　
Q：濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎？
A：這主要出現在初學者中，一般對電泳不會有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進入引起的。
　　處理辦法：按正確的操作方法操作。